Elucidação de Substâncias: Identificação e Caracterização Estrutural de Compostos Desconhecidos

Um pico observado em uma análise cromatográfica é apenas o ponto de partida. Para compreender sua origem e determinar sua identidade química, é necessário reunir diferentes evidências analíticas.

É nesse contexto que a elucidação estrutural de substâncias, também conhecida internacionalmente como structure elucidation ou substance elucidation, desempenha um papel estratégico.

A  Axios Research, empresa canadense sediada na região de Toronto, oferece suporte a projetos envolvendo isolamento de impurezas desconhecidas, caracterização estrutural, síntese customizada e desenvolvimento de padrões de referência.

O que é elucidação de substâncias?

A elucidação de substâncias é o processo científico utilizado para determinar, com base em evidências analíticas, a estrutura química de um composto cuja identidade ou estrutura não está completamente estabelecida.

Em um projeto de desenvolvimento farmacêutico, por exemplo, uma análise por HPLC pode revelar um pico inesperado. A espectrometria de massas pode indicar uma massa molecular compatível com determinadas fórmulas ou modificações estruturais, mas isso nem sempre é suficiente para distinguir entre estruturas possíveis.

Por isso, a elucidação estrutural normalmente utiliza uma estratégia analítica ortogonal, na qual diferentes técnicas fornecem informações complementares.

Entre as principais ferramentas utilizadas estão:

• RMN (Ressonância Magnética Nuclear), incluindo RMN 2D;

• HRMS – Espectrometria de Massas de Alta Resolução;

• LC-MS/LC-HRMS e técnicas de fragmentação;

• HPLC preparativo (Prep-HPLC);

• SFC – Cromatografia de Fluido Supercrítico;

• Espectroscopia no Infravermelho (IR);

• Cristalografia de Raios X de Cristal Único, quando aplicável;

• Síntese química e comparação com padrões de referência.

A combinação dessas técnicas permite construir uma evidência estrutural mais robusta do que a utilização isolada de uma única técnica analítica. A literatura científica apresenta, por exemplo, aplicações combinando HRMS, fragmentação, RMN 2D e isolamento de impurezas para determinar estruturas desconhecidas.

Por que a elucidação estrutural é importante?

A identificação de uma substância desconhecida pode ser necessária em diferentes momentos do ciclo de desenvolvimento de um produto.

Uma impureza pode estar relacionada:

• ao processo de síntese do IFA/API;

• a intermediários de reação;

• a subprodutos de reações químicas;

• a processos de degradação;

• a estudos de estabilidade;

• à formulação;

• a materiais de embalagem e possíveis lixiviáveis;

• a alterações de processo;

• a condições de armazenamento;

• ou a outros eventos que gerem novos componentes no perfil analítico.

A própria Axios Research destaca que impurezas podem surgir durante a fabricação do API, formulação e estudos de estabilidade, podendo estar relacionadas à degradação, intermediários, subprodutos, contaminação ou lixiviáveis de embalagem.

A ICH Q3A(R2) estabelece orientação para impurezas em novas substâncias medicamentosas, enquanto a ICH Q3B(R2) trata das impurezas em novos produtos farmacêuticos.

Importante: os limites e requisitos aplicáveis dependem do produto, contexto regulatório, dose e demais características do projeto. Portanto, os valores das diretrizes não devem ser tratados como um limite universal para qualquer substância.

Como funciona um projeto de elucidação de substâncias?

A estratégia pode variar de acordo com a natureza da amostra, quantidade disponível, complexidade molecular e objetivo do projeto.

De forma geral, o fluxo pode envolver as seguintes etapas:

1. Detecção do composto desconhecido

O processo pode começar pela identificação de um pico desconhecido em um cromatograma ou de um sinal analítico que não tenha sido previamente atribuído.

A primeira etapa é reunir as informações disponíveis sobre a amostra, processo, método analítico e possíveis origens do composto.

2. Isolamento da substância

Quando necessário, o composto desconhecido pode ser separado da matriz ou enriquecido para permitir sua caracterização.

A Axios Research informa utilizar técnicas como Prep-HPLC e Prep-SFC para o isolamento de impurezas desconhecidas.

Essa etapa é especialmente relevante quando a concentração do composto é baixa ou quando outras substâncias presentes na amostra interferem na caracterização.

3. Determinação da massa molecular e fórmula

A HRMS – High Resolution Mass Spectrometry fornece informações de alta precisão sobre a massa do composto.

A partir desses dados, podem ser avaliadas possíveis fórmulas moleculares e alterações em relação ao composto de origem.

Entretanto, massa exata não significa estrutura completamente determinada.

Diferentes estruturas podem apresentar massas moleculares compatíveis. Por isso, outras evidências são necessárias para avançar da hipótese estrutural para uma caracterização mais completa.

4. Análise por RMN

A Ressonância Magnética Nuclear (RMN) fornece informações importantes sobre o ambiente químico dos átomos presentes na molécula.

Experimentos de ¹H-RMN, ¹³C-RMN e RMN bidimensional, entre outros, podem contribuir para estabelecer conectividades, grupos funcionais e relações estruturais.

A RMN é amplamente utilizada na caracterização estrutural de materiais farmacêuticos, incluindo substâncias ativas, intermediários e impurezas.

A Axios Research informa possuir equipamentos de RMN de 500, 600 e 800 MHz, além de recursos para purificação e análise.

5. Espectroscopia no Infravermelho

A espectroscopia no infravermelho (IR) pode complementar os dados obtidos por outras técnicas, fornecendo informações relacionadas aos grupos funcionais presentes na substância.

Quando utilizada em conjunto com HRMS e RMN, contribui para aumentar a quantidade de evidências disponíveis para a interpretação estrutural.

6. Cristalografia de Raios X

Em determinados projetos, a cristalografia de Raios X de cristal único pode fornecer uma determinação tridimensional da estrutura molecular.

A Axios Research informa oferecer determinação confidencial de estruturas tridimensionais por cristalografia de Raios X, incluindo crescimento de cristais e interpretação dos dados.

Essa técnica pode ser particularmente valiosa quando outras abordagens não resolvem completamente determinadas questões estruturais.

Arsenal analítico ortogonal para elucidação estrutural

Uma das características mais importantes de um projeto de structure elucidation é a utilização de técnicas complementares.

RMN 2D
Permite investigar correlações entre núcleos e obter informações importantes sobre a conectividade e organização da molécula.

HRMS
Fornece a massa molecular com alta precisão e auxilia na determinação de possíveis fórmulas moleculares e padrões de fragmentação.

LC-MS/MS
A combinação entre cromatografia líquida e espectrometria de massas permite separar componentes e investigar seus padrões de fragmentação.

IR
Contribui para a identificação de grupos funcionais presentes no composto.

Cristalografia de Raios X
Quando há formação de um cristal adequado, pode fornecer informações estruturais tridimensionais de grande valor.
O objetivo não é simplesmente utilizar o maior número possível de técnicas, mas selecionar as técnicas adequadas à pergunta científica que precisa ser respondida.
A literatura apresenta diversos casos em que LC/HRMS e RMN foram utilizadas de forma complementar para estabelecer estruturas de impurezas farmacêuticas.

Elucidação de impurezas desconhecidas

A elucidação de impurezas é uma das aplicações mais relevantes desse tipo de investigação.

Uma impureza pode ser detectada durante:

• desenvolvimento de síntese;

• otimização de processo;

• estudos de estabilidade;

• investigação de desvios;

• desenvolvimento e validação de métodos analíticos;

• caracterização de API;

• análise de produtos de degradação;

• investigação de alterações no perfil cromatográfico.

O processo pode envolver detecção → isolamento → caracterização → confirmação estrutural → síntese ou aquisição de padrão de referência, dependendo do objetivo do projeto.

A Axios Research descreve justamente uma abordagem que combina isolamento de impurezas desconhecidas com técnicas analíticas para confirmação estrutural.

Estudos de degradação forçada e elucidação de produtos de degradação

A degradação forçada (forced degradation) pode ser utilizada para investigar possíveis rotas de degradação de uma substância sob condições controladas.

Dependendo do objetivo do estudo, podem ser avaliadas condições como:

• meio ácido;

• meio básico;

• oxidação;

• temperatura;

• luz;

• umidade;

• outras condições de estresse relevantes.

O aparecimento de novos sinais ou picos pode indicar a formação de produtos de degradação que posteriormente precisam ser investigados.

A literatura demonstra aplicações em que estudos de estresse foram combinados com LC-MS para acelerar a elucidação de impurezas desconhecidas.

Em um projeto de desenvolvimento, compreender qual produto se forma e em quais condições ele se forma pode contribuir para investigar sua origem e desenvolver estratégias para controlar sua formação.

Da estrutura desconhecida ao padrão de referência

A elucidação estrutural pode representar apenas uma etapa de um projeto maior.

Depois que a estrutura de uma impureza ou metabólito é estabelecida, pode existir a necessidade de produzir uma quantidade adequada do composto para utilização em estudos analíticos.

É nesse ponto que síntese customizada e padrões de referência podem complementar o trabalho de caracterização.

A Axios Research oferece serviços de síntese customizada, inclusive para compostos de difícil síntese e em escalas que podem variar de miligramas a quilogramas, conforme a viabilidade do projeto.

A Axios Research também apresenta entre seus serviços a elucidação de estruturas, isolamento de impurezas desconhecidas, síntese customizada e cristalografia de Raios X.

Elucidação de substâncias e padrões analíticos

Um composto estruturalmente caracterizado pode posteriormente ser utilizado como padrão de referência, quando adequado ao objetivo analítico.

Isso pode ser relevante para:

• identificação de impurezas;

• desenvolvimento de métodos;

• estudos de estabilidade;

• investigação de picos desconhecidos;

• desenvolvimento e validação de métodos;

• controle de qualidade;

• comparação de retenção cromatográfica;

• estudos quantitativos, quando o material e sua caracterização forem adequados ao uso pretendido.

É importante diferenciar pureza cromatográfica de valor atribuído/conteúdo quantitativo. A própria Axios Research ressalta que a utilização quantitativa de um padrão pode exigir avaliação de fatores adicionais, como água, solventes residuais, contraíons e resposta analítica.

Axios Research Canadá: expertise científica conectada ao Brasil

A Axios Brasil é a filial brasileira da Axios Research Inc., empresa canadense sediada na região metropolitana de Toronto.

Essa conexão permite aproximar cientistas e profissionais brasileiros da estrutura científica e dos serviços desenvolvidos pela matriz canadense.

A Axios Research informa atuar com:

• padrões de referência;

• impurezas farmacêuticas;

• metabólitos;

• compostos marcados isotopicamente;

• padrões internos;

• síntese customizada;

• isolamento e elucidação de impurezas;

• cristalografia de Raios X;

• suporte analítico.

A empresa também informa que sua equipe de liderança reúne mais de 100 anos de experiência combinada entre cientistas e executivos do setor.

O papel da Axios Brasil

Para empresas e laboratórios no Brasil, a Axios Brasil atua como ponto de contato para demandas relacionadas a padrões de referência e soluções científicas personalizadas, conectando o mercado brasileiro à Axios Research Canadá.

Quando considerar um projeto de elucidação estrutural?

A investigação pode ser relevante quando seu laboratório identifica:

Um pico desconhecido no HPLC?
→ Pode ser necessário investigar sua origem e identidade.

Uma nova impureza durante o desenvolvimento do processo?
→ A caracterização estrutural pode ajudar a compreender sua formação.

Um produto de degradação inesperado?
→ Estudos analíticos e de estresse podem auxiliar na investigação.

Uma estrutura que precisa ser confirmada?
→ Técnicas ortogonais podem fornecer evidências complementares.

Necessidade de um padrão de referência que não está disponível comercialmente?
→ A síntese customizada pode ser avaliada.

Uma molécula complexa ou difícil de caracterizar?
→ Um projeto integrado de isolamento, análise e elucidação pode ser considerado.

Perguntas frequentes sobre elucidação de substâncias

O que significa elucidação de substâncias?

É o processo científico de determinar a identidade e/ou estrutura química de uma substância utilizando evidências obtidas por técnicas analíticas complementares.

O que é substance elucidation?

Substance elucidation é uma expressão em inglês associada à investigação da identidade e estrutura de uma substância. Em literatura técnica farmacêutica, também é muito utilizado o termo structure elucidation, especialmente para descrever a determinação da estrutura de compostos desconhecidos, impurezas e produtos de degradação.

Qual a diferença entre identificação e elucidação estrutural?

A identificação pode indicar qual é o composto ou fornecer uma atribuição baseada em comparação com um padrão conhecido. A elucidação estrutural envolve a obtenção e interpretação de evidências que permitam estabelecer a estrutura química do composto.

Qual técnica é utilizada para elucidar uma substância desconhecida?

Não existe uma única técnica universal. Dependendo do projeto, podem ser combinadas HPLC, LC-MS, HRMS, MS/MS, RMN, IR, cristalografia de Raios X e outras ferramentas analíticas.

HRMS é suficiente para determinar uma estrutura?

Nem sempre. A massa exata pode restringir as possibilidades estruturais, mas diferentes estruturas podem apresentar a mesma fórmula molecular. Por isso, informações de fragmentação, RMN e outras técnicas podem ser necessárias para uma caracterização mais completa.

A Axios Research realiza elucidação de impurezas?

Sim. A Axios Research informa oferecer isolamento e elucidação de impurezas, incluindo isolamento de compostos desconhecidos e posterior análise por diferentes técnicas para confirmação estrutural.

A Axios Brasil atende projetos de elucidação no Brasil?

A Axios Brasil apresenta entre seus serviços a elucidação de estruturas e isolamento de impurezas desconhecidas, conectando clientes brasileiros à estrutura e expertise da Axios Research Canadá.

Precisa identificar uma substância desconhecida?

Um pico desconhecido não precisa permanecer desconhecido.

A Axios Brasil conecta empresas e laboratórios brasileiros à expertise da Axios Research Canadá para projetos envolvendo isolamento de impurezas, elucidação estrutural, caracterização analítica, síntese customizada e padrões de referência.

Envie os dados disponíveis do seu projeto e converse com nossa equipe técnica sobre a viabilidade da demanda.

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