As fases estacionárias à base de sílica em cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, em inglês) são limitadas a uma faixa de trabalho de pH entre 2 e 8. As fases estacionárias mais populares em HPLC são de sílicas, mas trabalhar fora dessa faixa de pH pode levar a alterações no tempo de retenção, perda de desempenho e consequentemente, custos laboratoriais mais elevados devido à rápida deterioração da fase. A plataforma Kromasil® EternityXT foi desenvolvida com um organosilano mesclado à sílica para formar um material resistente à degradação alcalina.
Teste acelerado de estabilidade química:
A estabilidade química do material foi avaliada aplicando testes de estabilidade acelerada em temperaturas elevadas, utilizando tampões carbonatados 10 mM em pH alto (esquerda) e TFA 0,1% em pH baixo (direita) para hidrolisar a fase estacionária de sílica.
Figura 1: Hidrólise básica da Kromasil® EternityXT usando acetonitrila/carbonato de amônio 10 mM, pH 10,5 [10/90] @ a 60°C, 0,2 mL/min e hidrólise ácida com metanol/água/TFA [5/95/0,1] a 80°C, 0,2 mL/min. Análise feita com acetonitrila/água [70/30] @ 25°C, 1 mL/min usando fenantreno como substância de teste
Teste de vida útil com injeções repetidas:
As colunas foram testadas em condições adversas para múltiplas injeções, mostrando consistência e resultados reprodutíveis em termos de eficiência e simetria de pico.
Figura 2. Teste de vida útil da Kromasil EternityXT 5-C18 com 1.000 injeções. Fase móvel em pH baixo acetonitrila/fosfato de sódio @ pH 2,5 [50/50] e em pH alto acetonitrila/carbonato de amônio 10 mM pH 10,5 [70/30]. Acetofenona e tolueno foram utilizados como substâncias de teste a uma vazão de 1,0 mL/min.
Figura 3. Teste de vida útil do Kromasil EternityXT 2.5-C18 com 3.000 injeções sob condições básicas usando acetonitrila/carbonato de amônio 10 mM pH 10,5 [10/90] a 60°C, 0,2 mL/min. Acetofenona e tolueno foram usados como substâncias de teste a uma vazão de 1,0 mL/min.
Ajustando a seletividade em diferentes pH
Ao alterar as condições de pH na análise, a seletividade pode ser alterada conforme visto na figura 4, com uma amostra da mistura de compostos neutros, ácidos e básicos. Os fármacos básicos estão na forma ionizada quando o pH na fase móvel é inferior ao pKa, portanto os compostos básicos apresentarão tempos de retenção baixos em pH baixo na fase reversa da cromatografia. Quando os compostos básicos são neutralizados a duas unidades acima do pKa, os tempos de retenção tornam-se mais longos.
Figura 4. Mudança de seletividade em uma EternityXT 2.5-C18 de 2,1 x 50 mm usando fosfato de sódio 20 mM em pH 2,1, 7,2, 11,3. As condições utilizadas foram fase móvel A fosfato de sódio 20 mM, fase móvel B acetonitrila, gradiente 0 – 0,5 min 10% B, 5,5 min 50% B usando uma taxa de fluxo de 1,5 mL/min com detecção UV @ 254 nm
Com a possibilidade de utilizar as fases em uma ampla faixa de pH, a seletividade pode ser melhorada alterando a fase móvel, como visto na figura 5 para anti-inflamatórios, e na figura 6 para triagem rápida de peptídeos. Demonstrando o benefício de se trabalhar em pH baixo e alto para explorar a seletividade e o poder de resolução em cromatografia analítica, e subsequentemente em alta escala.
Figura 5. Estudo de anti-inflamatórios analisados usando Kromasil EternityXT 5-C8 em pH baixo usando A 0,1% de ácido fórmico em água e B 0,1% de ácido fórmico em acetonitrila, gradiente 0 min 40% B, 15 min 70% B. Para pH alto, a fase móvel foi A 10 mM de bicarbonato de amônio pH 10,5 e B acetonitrila, gradiente 0 min 22,5% B, 10 min 35% B. A taxa de vazão para a análise foi de 1 mL/min com detecção de UV a @230 nm à temperatura ambiente.
Figura 6. Separação de Angiotensina I, II e III usando coluna EternityXT 1.8-C18 de 50 x 2,1 mm. Fase móvel em pH baixo, A 0,1% TFA em água (pH 1,9), fase móvel B 0,1% TFA em acetonitrila, gradiente 0 min 9% B, 10 min 36% B, vazão 0,7 mL/min, detecção UV @ 220 nm. As condições para pH alto, fase móvel A 0,1% de hidróxido de amônio em água (pH 11,0), fase móvel B acetonitrila, gradiente 0 min 5% B, 10 min 40% B, vazão 0,7 mL/min, detecção UV @ 225 nm.
Este trabalho mostra os benefícios do uso de colunas quimicamente e mecanicamente estáveis para operar em uma ampla faixa de pH. Como a sílica mesclada com organossilano, linha Eternity XT da Kromasil, que possui uma ampla faixa de trabalho, os laboratórios têm a opção de ajustar a seletividade alterando o pH.