Guia Prático de Purificação Utilizando Peptídeos Agonista GLP-1

Metodologia para maximizar a pureza e o rendimento na purificação de Liraglutida e Semaglutida.

Um Guia Prático de Purificação para alcançar suas metas de purificação.

Os agonistas GLP-1 são uma família de peptídeos que se tornaram populares no tratamento precoce do diabetes tipo II. Alcançar a pureza certa para estes peptídeos é, no entanto, bastante desafiador.

Um conjunto de métodos de purificação foi desenvolvido utilizando fases estacionárias Kromasil® para a remoção de impurezas em peptídeos brutos, que podem ser combinados de forma sistemática para melhorar a pureza do bruto em até 99,5%. Este conjunto é chamado de Guia Prático de Purificação do agonista do GLP-1.

Com um conjunto de métodos e rotinas de purificação bem adaptados, a alta eficiência e a longa vida útil da coluna podem ser mantidas para maximizar o rendimento e a produtividade.

Liraglutida e Semaglutida

Liraglutida e Semaglutida são alguns dos principais agonistas do GLP-1 produzidos comercialmente no mercado. Elas têm algumas substituições de aminoácidos em comparação com o GLP-1 humano, para retardar a degradação da peptidase e são ambos acetilados com uma cadeia lateral de hidrocarboneto.

Contudo, se manuseados de forma inadequada durante a purificação, degradam-se ou agregam-se facilmente. A maioria desses problemas são evitados ao usar os métodos do Guia Prático de Purificação.

Representação da estrutura da Liraglutida

(pdb id 4 apd) usando o Visualizador Mol* (D. Sehnal et al (2021)

Pesquisa de ácidos nucléicos. doi: 10.1093/nar/gkab314) e RCSB PDB.

Alcançando a pureza

Os brutos de liraglutida normalmente apresentam pureza na faixa de 10 a 50% ao entrar no processamento seguinte. O objetivo do Guia Prático de Purificação é oferecer métodos de purificação que levem a pureza de até 99,5%.

Perfis típicos de pureza bruta para liraglutida

Seleção de ferramentas

Alterando os principais fatores que afetam a eficiência da cromatografia em HPLC, foram testadas muitas combinações diferentes das seguintes propriedades:

• Fase estacionária Kromasil®
• Solvente orgânico em fase móvel
• Buffer da fase móvel

A união dos diversos testes gerou um conjunto de combinações de métodos com foco na remoção das impurezas anteriores e posteriores do material bruto.

Metodologia do Guia Prático de Purificação

Impurezas anteriores                            Impurezas posteriores

Num produto bruto típico, as impurezas podem ser agrupadas como impurezas de entrada e de saída.

O processo científico ideal consiste em selecionar dois métodos do Guia Prático de Purificação que terão como alvo as impurezas frontais e posteriores do produto bruto. Em alguns casos, isto pode ser conseguido num único passo.

Guia Prático de Purificação para a purificação da semgalutida.

Guia Prático para a purificação da Liraglutida

Exemplos com Semaglutida

Neste exemplo, começando com um bruto de Semaglutida com 30% de pureza, o método de duas etapas utiliza Kromasil® C4 em ambas as etapas, mas em pH diferente, obtivemos  92,2% de pureza após a primeira etapa e 99,5% após a segunda etapa.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas  antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-c4

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: ácido trifluoroacético (TFA)

Etapa 2 da purificação:

Exemplo com Semaglutida usando tampões de fosfato.  Partindo também do bruto com 30% de pureza, as primeiras etapas em pH baixo atingem 90,5% de pureza. A segunda etapa é executada em pH neutro, atingindo a pureza final de 99,5%.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-c4

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: fosfato de potássio, pH baixo

Etapa 2 da purificação:

Exemplo usando a nova fase Kromasil® diC4 para agonistas do receptor GLP-1 e Kromasil® Fenil com 2 etapas de tampão bastante neutras com fosfato de potássio e acetato de amônio, respectivamente

iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas mais a frente, antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-c4

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: fosfato de potássio, pH neutro

Etapa 2 da purificação:

Exemplos com Liraglutida

Neste primeiro exemplo, começando com um bruto com 50% de pureza, o primeiro método usando Kromasil® Fenil visa as impurezas frontais, obtendo uma pureza de 94%. Para atingir uma pureza final acima de 99,5%, uma segunda etapa no Kromasil® C4 é executada, removendo as impurezas restantes.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas mais a frente, antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-fenil

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: carbonato de amônia

Etapa 2 da purificação:

Neste segundo exemplo, começando com outro bruto com 50% de pureza, O primeiro método usando Kromasil® C8 visa impurezas frontais e posteriores, atingindo 98% de pureza. Para atingir a pureza final acima de 99,5%, a segunda etapa é executada em Kromasil® C4, removendo as impurezas restantes.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas mais a frente, antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-c8

Fase móvel com solvente orgânico: etanol

Solução tampão: acetato de amônia

Etapa 2 da purificação:

Neste terceiro exemplo, começando com uma liraglutida bruta, com pureza de 15%, e executando ambas as etapas em Kromasil® diC4, aumenta-se a pureza para 97,1% e finalmente para 99,5%.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas mais a frente, antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-c4

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: carbonato de amônia. pH neutro

Etapa 2 da purificação:

Este quarto exemplo é semelhante ao anterior, mas com um produto bruto diferente, com 20% de pureza de liraglutida. Ambas as etapas também são executadas em Kromasil® diC4, aumentando a pureza para 96,4% e, finalmente, virtualmente para 100%.

Iniciando o bruto, com foco no pico do produto. Outras impurezas são encontradas mais a frente, antes e depois da área de foco.

Etapa 1 da purificação:

Condições:

Fase estacionária: Kromasil 100-10-di C4

Fase móvel com solvente orgânico: acetonitrila

Solução tampão: carbonato de amônia. pH neutro

Etapa 2 da purificação:

Fazendo isso direito

Embora os peptídeos brutos possam ser desafiadores quando injetados repetidamente em uma coluna de HPLC, ter uma rotina de regeneração pode ser benéfico para manter uma boa vida útil e eficiência da coluna e, assim, a produtividade do processo.

Solução de problemas de aumento da contrapressão

Ao purificar peptídeos brutos demandantes como a Liraglutida, rapidamente a coluna fica  suja por impurezas absorvidas pelas repetidas injeções, mesmo após realizar uma lavagem tradicional de 2 colunas de volume  entre as injeções.

Propomos aqui a realização de uma lavagem adicional em condições amenas após uma sequência de injeções, para recuperar rápida e totalmente a capacidade e eficiência da coluna, otimizando a produtividade e o rendimento.

Figura mostrando a contrapressão aumentando sobre a coluna,  entre as 30 injeções brutas consecutivas de A a B. C mostra a contrapressão normal restaurada após a lavagem adicional da coluna.

Os cromatogramas que ilustram o estado nestes três pontos são mostrados nas figuras a seguir.

A – Injeção inicial

B – Após 30 injeções sequenciais de preparado

Após 30 injeções de preparado, a eficiência da coluna é prejudicada, resultando em menor pureza nas frações extraídas.

No  cromatograma preparativo, o formato inicial do pico é mostrado em azul claro como referência.

C – Após lavagem regeneradora suave

Após a lavagem de regeneração, a forma do pico e, portanto, a eficiência e a pureza foram praticamente restauradas. A lavagem suave permite uma rápida manutenção para prosseguir com novas injeções.

No cromatograma preparativo, o formato inicial do pico é mostrado em azul claro como referência.

Semaglutida (em vermelho) interagindo com o receptor GLP-1 (em azul)

Disponibilidade do Kromasil® Clássico

• Produto padrão, disponível em grandes quantidades

• Produto analítico, disponível apenas em colunas com pasta fluida

• Produto de sílica pura em tamanhos de partículas analíticas, disponível a granel para produtores OEM contratados

Entre em contato:

Você também está trabalhando em alguns peptídeos agonistas do GLP-1 e está interessado em saber como este Guia Prático de Purificação pode reduzir seu tempo de desenvolvimento e aumentar sua produtividade? Não hesite entrar em contato e falar diretamente com a nossa equipe de cientistas especialistas para obter mais detalhes.